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脈沖瞬態(tài)葉綠素熒光儀的研發(fā)
郝建卿1 白瑜2 張榮2 鄭彩霞1 高榮孚1
1．北京林業(yè)大學 生物科學與技術(shù)學院植物生理教研組 2．北京雅欣理儀科技有限公司
Schreiber（2004）和 Strasser（2004）的文章代表當前葉綠素熒光儀的主流方向，Walz公司的PAM調(diào)制型熒光儀在1986年推出后深受廣大研究者歡迎，成為研究葉綠素熒光動力學主流。隨后其他一些公司，也陸續(xù)推出相應的儀器。非調(diào)制的瞬態(tài)熒光儀由于電子元件器件和單片機數(shù)據(jù)采集器等的發(fā)展，克服了F0測定問題，在1990年后，以Hansa公司的PEA及有關(guān)新的型號為主，順應了在光抑制和非還原中心的相關(guān)研究需要。
近些年來，瞬態(tài)熒光技術(shù)得到了較大的發(fā)展，特別是OJIP（或OKJIP）及其他相關(guān)的研究（Stasser 2001）。zui近更由于熒光動力學模型及相關(guān)模擬技術(shù)的發(fā)展，主要以瞬態(tài)熒光為基礎(chǔ)的（Laisk 等主編Photosynthesis in silico）模擬技術(shù)，更使瞬態(tài)熒光儀有了新的發(fā)展。但是調(diào)制熒光儀以F0、Fm、Fm'、F0'和Fs等基本參數(shù)為基礎(chǔ)可以計算多種熒光動力學參數(shù)，仍是當前葉綠素熒光動力學研究的主要內(nèi)容。同時我們從2005年開始，研究后穩(wěn)態(tài)誘導熒光動力學，有可能進一步發(fā)展在后穩(wěn)態(tài)條件下的相關(guān)參數(shù)。鑒于非調(diào)制的瞬態(tài)熒光儀相對較簡單，結(jié)合調(diào)制型的飽和脈沖技術(shù)，開發(fā)了脈沖瞬態(tài)熒光儀（Pulse Transition-Fluorescence Meter，商品名Yaxin
一、儀器相關(guān)參數(shù)
飽和脈沖光強強度范圍：0-5000 µmol ·photon ·m-2s-1
光化光光強強度范圍：0-2000µmol ·photon ·m-2s-1
采樣速率5µs 可變
A/D 12位
二、測定結(jié)果
1． 典型瞬態(tài)模式測定
該模式下，可得到典型的OJIP的數(shù)據(jù)，觀察到不同光化光強度條件下的OJIP曲線及其相關(guān)參數(shù)，如圖1所示。
圖1 不同光化光強度條件下的OJIP曲線
注1：盆栽綠蘿放入暗室，暗適應2h后測定不同光化光強度下OJIP的變化。如上圖所示，測定強度從上到下一次為3500、3000、2500、2500、2000、1500、1000、500、200、100和50µmol ·photon ·m-2s-1等，光化光持續(xù)時間均為10s。
表1 不同光化光強度條件下測得的相應的參數(shù)
| 測量項目 | AL（T） | Total Time /s | F0 | Fm | Fv/Fm |
| OJIP | 50（10） | 10 | 7 | 12 | 0.42 |
| OJIP | 100（10） | 10 | 9 | 31 | 0.71 |
| OJIP | 200（10） | 10 | 16 | 81 | 0.8 |
| OJIP | 500（10） | 10 | 39 | 203 | 0.81 |
| OJIP | 1000（10） | 10 | 76 | 417 | 0.82 |
| OJIP | 1500（10） | 10 | 113 | 582 | 0.81 |
| OJIP | 2000（10） | 10 | 149 | 775 | 0.81 |
| OJIP | 2500（10） | 10 | 167 | 971 | 0.83 |
| OJIP | 3000（10） | 10 | 214 | 1124 | 0.81 |
| OJIP | 3500（10） | 10 | 253 | 1423 | 0.82 |
2．脈沖瞬態(tài)熒光動力學測定
該模式下可得F0、Fm、Fm'、F0'和Fs五項參數(shù)，用于類似調(diào)制式熒光儀相關(guān)參數(shù)的計算。同時可以獲得從暗適應后*個飽和脈沖的到的OJIP圖形，還能得到第2個脈沖及以后各個脈沖相關(guān)變化，即J和P的相關(guān)變化。如圖2所示。
圖2 脈沖瞬態(tài)不同光化光強度條件下OJIP曲線
注：盆栽綠蘿放入暗室，暗適應2h后進行不同光化光強度下，脈沖瞬態(tài)熒光動力學的測量。如上圖所示，測定強度依次為50、100、500和1800。測量過程中，飽和脈沖強度設(shè)為5000，設(shè)置光化光梯度，測量時間為儀器本身設(shè)置，飽和光1s，光化光9s，共10s，設(shè)置測量時間為300s。300s測量時間結(jié)束，開始施加遠紅光時長4s，黑暗時長1s，接著有個短的飽和脈沖出現(xiàn)獲取F0'后，整個測量結(jié)束。
表2 脈沖瞬態(tài)熒光動力學測定所得的相關(guān)參數(shù)
| 測量 項目 | SL（T） | （T） | Total Time/S | FR T/S | Dark T/s | F0 | Fm | Fv/Fm | F0' | Fm' | Fs | qP | qN | ΦPSII |
| 脈沖瞬態(tài) | 5000（1） | 50（9） | 300 | 4 | 1 | 319 | 1536 | 0.79 | 303 | 1190 | 474 | 0.807 | 0.271 | 0.602 |
| 脈沖瞬態(tài) | 5000（1） | 100（9） | 300 | 4 | 1 | 273 | 1462 | 0.81 | 271 | 973 | 485 | 0.695 | 0.41 | 0.502 |
| 脈沖瞬態(tài) | 5000（1） | 200（9） | 300 | 4 | 1 | 361 | 2197 | 0.84 | 354 | 997 | 585 | 0.641 | 0.65 | 0.413 |
| 脈沖瞬態(tài) | 5000（1） | 300（9） | 300 | 4 | 1 | 383 | 1928 | 0.8 | 360 | 1015 | 604 | 0.627 | 0.576 | 0.405 |
| 脈沖瞬態(tài) | 5000（1） | 500（9） | 300 | 4 | 1 | 345 | 2161 | 0.84 | 347 | 914 | 593 | 0.566 | 0.688 | 0.351 |
| 脈沖瞬態(tài) | 5000（1） | 800（9） | 300 | 4 | 1 | 355 | 2100 | 0.83 | 306 | 677 | 530 | 0.396 | 0.787 | 0.217 |
| 脈沖瞬態(tài) | 5000（1） | 800（9） | 300 | 4 | 1 | 348 | 2205 | 0.84 | 294 | 601 | 525 | 0.248 | 0.835 | 0.126 |
| 脈沖瞬態(tài) | 5000（1） | 1000（9） | 300 | 4 | 1 | 342 | 2181 | 0.84 | 308 | 678 | 595 | 0.224 | 0.799 | 0.122 |
| 脈沖瞬態(tài) | 5000（1） | 1500（9） | 300 | 4 | 1 | 324 | 1819 | 0.82 | 285 | 542 | 492 | 0.195 | 0.828 | 0.092 |
| 脈沖瞬態(tài) | 5000（1） | 1800（9） | 300 | 4 | 1 | 316 | 1907 | 0.83 | 270 | 525 | 487 | 0.149 | 0.84 | 0.072 |
| 脈沖瞬態(tài) | 5000（1） | 2000（9） | 300 | 4 | 1 | 304 | 1880 | 0.84 | 268 | 509 | 478 | 0.129 | 0.847 | 0.061 |
3．后穩(wěn)態(tài)誘導熒光動力學測定
達到穩(wěn)態(tài)后，由于接著再給飽和脈沖、黑暗以及遠紅光的誘導，所以在光化光誘導下可產(chǎn)生后穩(wěn)態(tài)誘導熒光動力學。如圖3 所示。
圖3后穩(wěn)態(tài)不同光化光強度條件下OJIP曲線
注：盆栽綠蘿放入暗室，暗適應2h后進行不同光化光強度下，后穩(wěn)態(tài)熒光動力學的測量。如上圖所示，測定強度依次為50、100、500和1800。測量過程中，飽和脈沖強度設(shè)為5000，設(shè)置光化光梯度，測量時間為儀器本身設(shè)置，飽和光1s，光化光10s，共11s。*個飽和光之前葉片暗適應，然后開始測量，發(fā)出*個飽和光，飽和光完成后，施加遠紅光（4s）、黑暗（1s）、光化光（10s），然后又是一個飽和光，這樣就完成了2次測量，即2個飽和光出現(xiàn)過了。本次實驗設(shè)置了20次測量，整個測量過程中飽和光會出現(xiàn)20次，這20個飽和光中間，隔著遠紅光、黑暗和光化光，zui后一個飽和光完成后，測量結(jié)束。
表3 后穩(wěn)態(tài)熒光動力學測定所得的相關(guān)參數(shù)
| 測量項目 | SL（T） | AL（T） | Total T | FR Time/s | Dark T/s | F0 | Fm | Fv/Fm |
| 后穩(wěn)態(tài) | 5000（1） | 50（10） | 20次 | 4 | 1 | 365 | 1909 | 0.81 |
| 后穩(wěn)態(tài) | 5000（1） | 100（10） | 20次 | 4 | 1 | 356 | 2296 | 0.84 |
| 后穩(wěn)態(tài) | 5000（1） | 200（10） | 20次 | 4 | 1 | 362 | 1859 | 0.81 |
| 后穩(wěn)態(tài) | 5000（1） | 500（10） | 20次 | 4 | 1 | 352 | 2024 | 0.83 |
| 后穩(wěn)態(tài) | 5000（1） | 800（10） | 20次 | 4 | 1 | 382 | 1925 | 0.8 |
| 后穩(wěn)態(tài) | 5000（1） | 1000（10） | 20次 | 4 | 1 | 372 | 1918 | 0.81 |
| 后穩(wěn)態(tài) | 5000（1） | 1200（10） | 20次 | 4 | 1 | 357 | 1908 | 0.81 |
| 后穩(wěn)態(tài) | 5000（1） | 1200（10） | 20次 | 4 | 1 | 338 | 1750 | 0.81 |
| 后穩(wěn)態(tài) | 5000（1） | 1800（10） | 20次 | 4 | 1 | 325 | 1649 | 0.8 |
| 后穩(wěn)態(tài) | 5000（1） | 2000（10） | 20次 | 4 | 1 | 246 | 1412 | 0.83 |
4．循環(huán)電子傳遞和線性電子傳遞相關(guān)性的測定
穩(wěn)態(tài)熒光后，如果停止光化光，P680停止電子輸出，而P700在遠紅光繼續(xù)傳遞電子，是光合電子進入循環(huán)式電子傳遞，大約需10s或更長一段時間后，突然有光化學誘導使P680發(fā)出電子。在這一過程就可以了解電子的情況。如圖4所示。
圖4 不同遠紅光時長下OJIP曲線
參考文獻
Schreiber U.Chlorophyll Fluorescence: a Signature Photosynthesis.pp279-319. Eds by Papageorgiou G.C., Govindjee. Springer （2004）.
Strasser,R.J. Ibid. Pp 321-362.
試驗日期：2011年7月
試驗地點：北京林業(yè)大學生科院
儀器生產(chǎn)商：北京雅欣理儀科技有限公司
